Las técnicas de abajo arriba hoy son las utilizadas para la mayor parte de la labor de análisis de muestras biológicas: en la «proteómica de perdigonada» se analizan las proteínas de mezclas complejas utilizando una combinación de CL de alto rendimiento y EM/EM. Una posible advertencia respecto a esta técnica es que el espectrómetro de masas selecciona el ion precursor más abundante para la fragmentación. Por consiguiente, la detección de las proteínas abundantes es más probable que la de las escasas. El muestreo insuficiente es especialmente problemático en el caso de muestras como las de plasma o suero, que corresponden al proteoma más complejo del cuerpo humano, con proteínas que son de entre 10 y 12 órdenes de magnitud en el rango dinámico lineal13. Los espectrómetros de masas actuales solamente resuelven de 4 a 5 órdenes de magnitud. Aunque un solo péptido puede ser suficiente para identificar sin ambigüedad una proteína, son necesarios múltiples péptidos de la misma proteína para una cuantificación fiable en la proteómica de perdigonada. Hasta la fecha, la mayoría de los estudios de proteómica que han analizado muestras de plasma han fracasado en el intento de identificar nuevos biomarcadores debido a que las proteínas poco abundantes son difíciles de detectar en presencia de componentes muy abundantes como la albúmina. El problema del muestreo insuficiente del proteoma plasmático se podría superar en parte con técnicas que utilizan una depleción de las proteínas plasmáticas abundantes. Una estrategia alternativa es el empleo de tejido enfermo, en el que hay un enriquecimiento de biomarcadores. Puede usarse una estrategia más específica en el plasma/suero una vez identificado el biomarcador candidato.

La monitorización por reacción múltiple en un espectrómetro de masas de triple-cuadrupolo (QqQ-EM) se aplica a péptidos o metabolitos identificados en los experimentos de descubrimiento14,15. Una QqQ-EM proporciona una forma efectiva y exacta de cuantificar unas pocas moléculas diana seleccionadas, incluso en mezclas complejas como el plasma o el suero15. Si se puede ionizar la molécula de interés mediante ionización por electrospray, la QqQ-EM tendrá una interfase con un sistema de CL para la separación del producto analizado, tal como se ha mencionado antes. La molécula precursora se selecciona entonces en el primer cuadrupolo. El segundo cuadrupolo se emplea como cámara de colisión para la fragmentación. Los iones producidos son detectados en el tercer cuadrupolo, y su intensidad es un indicador de la abundancia de la molécula de origen16. Dada su alta especificidad, la monitorización por reacción múltiple se emplea para la validación de biomarcadores candidatos identificados en los experimentos de descubrimiento17, pero se ha empleado también con éxito para confirmar lugares específicos de fragmentación de las proteínas18. Además, la QqQ-EM es el método de elección para los estudios de metabolómica dirigida empleando metabolitos estándares como calibradores19.

La ERM es menos sensible que la EM, pero es notablemente cuantitativa y aporta ventajas en la cuantificación de los metabolitos en tejidos intactos y en extractos de tejidos26. Esta técnica se basa en que ciertos núcleos con un número de nucleones (protones o neutrones) impar poseen una propiedad denominada espín nuclear. Las resonancias de los núcleos excitados mediante radiofrecuencias específicas pueden medirse para producir una señal bien definida. Los protones (1H) son con frecuencia los núcleos de elección para el parámetro de espín, ya que son abundantes. Empleando ácido perclórico, se puede extraer los metabolitos hidrosolubles directamente de corazones sometidos a congelación brusca. La 1H-ERM proporciona una forma cuantitativa de medir los metabolitos hidrosolubles presentes en estos extractos de metabolitos27. Se utiliza un patrón de referencia interno para calibrar las desviaciones químicas en los espectros para las identificaciones de los metabolitos. Es importante señalar que el área del pico que corresponde a la señal de cada metabolito puede calcularse mediante la comparación con el patrón de referencia interno para obtener valores cuantitativos. Pueden examinarse al mismo tiempo muchas clases de moléculas en las muestras extraídas, sin partir de supuestos previos respecto a los tipos de moléculas. Esto hace que la 1H-ERM sea un método excelente para abordar los análisis no dirigidos. La 1H-ERM muestra su potencia a la sensibilidad requerida principalmente en extractos ácidos. La sensibilidad y la resolución se reducen en los tejidos sólidos. Se puede analizar los tejidos sólidos empleando una técnica denominada 1H-ERM con spinning de ángulo mágico de alta resolución. El estado energético de una célula o un tejido determinados se puede evaluar con ERM de fósforo (31P-ERM). Esta permite la detección de metabolitos energéticos cardiacos de vida corta como fosfocreatina y adenosintrifosfato, así como fosfato inorgánico y el pH intracelular. La 31P-ERM también es adecuada para determinaciones in vivo e in vitro28,29.

La metabolómica basada en EM proporciona un método muy sensible de recopilar la información de un perfil metabólico, especialmente en los líquidos corporales30. Se han realizado análisis metabolómicos basados en el plasma después de una isquemia miocárdica31, pruebas de esfuerzo y pacientes prediabéticos32. Los metabolitos se separan antes de la identificación mediante espectrofotometría de masas, utilizando para ello cromatografía de gases o CL. Al igual que en la proteómica, los avances recientes en las tecnologías de EM han transformado nuestra capacidad de establecer un perfil de metabolitos no solo en solución, sino también directamente a partir de cortes de tejido. Por ejemplo, Manicke et al33 aplicaron una EM con ionización por electrospray de desorción para visualizar e identificar especies moleculares de lípidos en placas de origen humano. En otro estudio se mostró el uso de técnicas de imagen de moléculas pequeñas mediante EM en tejido cardiaco de ratón34. Nosotros utilizamos los avances más recientes de la EM en lipidómica de perdigonada para comparar el contenido lipídico de lesiones de aterosclerosis humanas bien definidas. Comparando las muestras de endarterectomía de pacientes sintomáticos y asintomáticos y áreas estables e inestables de la misma lesión sintomática, delimitamos las firmas de lípidos características para determinar la vulnerabilidad de la placa18.

A diferencia del genoma, el proteoma y el metaboloma son dinámicos y están mucho más próximos al fenotipo de la enfermedad (Fig.). Así pues, podrían conducir a un mejor conocimiento de los procesos que causan que la ECV se manifieste y progrese. Actualmente, las técnicas de proteómica pueden identificar hasta 5.000 proteínas en una muestra biológica/clínica compleja, pero las plataformas de proteómica están en continua evolución y amplían las fronteras de la instrumentación analítica35. En la investigación cardiovascular, el rango dinámico de la expresión proteica a que dan lugar las proteínas de miofilamentos abundantes (p. ej., tropomiosinas, miosinas, titina) dificulta la detección de las proteínas poco abundantes en los miocardiocitos. En consecuencia, los investigadores han desarrollado métodos analíticos dirigidos a subproteomas específicos, como los de los miofilamentos cardiacos36, las mitocondrias cardiacas37, las membranas celulares38 o el núcleo celular39. Nosotros hemos caracterizado recientemente el remodelado de la matriz extracelular vascular en aneurismas de aorta abdominal humanos, así como la fibrosis inicial y tardía, en un modelo porcino de isquemia/lesión de reperfusión40,41. Con la determinación de los niveles de expresión de proteínas sin partir de supuestos establecidos a priori, las tecnologías avanzadas pueden generar nuevas hipótesis y desplazar el centro de interés actual de la determinación cuantitativa a las diferencias cualitativas en la fibrosis cardiaca que pueden modificar la progresión de la enfermedad. Las técnicas «ómicas» abordan las interacciones complejas que se dan dentro de los sistemas biológicos desde un punto de vista holístico, en particular las interacciones que afectan a la fisiopatología de la enfermedad. Anteriormente, los enfoques reduccionistas convencionales trataban las cascadas de señalización intracelulares como modelos lineales, considerando las moléculas involucradas confinadas a una única vía de señal. Sin embargo, las diferentes vías interactúan entre sí y están organizadas en forma de redes que incluyen tanto proteínas como moléculas pequeñas42. La bioinformática ha pasado a ser un instrumento esencial para analizar y visualizar de manera completa estas interacciones, y bases de datos como la KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) o Reactome establecen mapas de enzimas/metabolitos regulados dentro de diferentes redes metabólicas43. Así pues, la combinación de proteómica y metabolómica proporciona una lectura complementaria que mejora la fiabilidad de la interpretación de los datos44 y ofrece un conjunto de instrumentos no sesgados para interrogar al metabolismo cardiovascular45,46.

Figura.

Biología de sistemas. Los procesos reguladores en el ADN afectan a la expresión de moléculas de procesos posteriores, como los ARN, las proteínas y los metabolitos. Los efectos de los diferentes elementos reguladores son aditivos. La biología de sistemas intenta analizar las interacciones entre las diferentes entidades moleculares para ofrecer una visión holística de los procesos biológicos y las alteraciones patológicas que se producen en la enfermedad.

(0.53MB).

La fibrilación auricular (FA) conduce a varias formas diferentes de remodelado auricular, denominadas eléctrico, contráctil y estructural. Empleando técnicas de proteómica y metabolómica para analizar la muestra de orejuela auricular derecha de pacientes en ritmo sinusal y FA permanente, observamos una posible nueva forma de remodelado auricular-remodelado metabólico47. Varias enzimas involucradas en el metabolismo de la glucosa, los lípidos y la energía fueron alterados durante la FA. Los resultados proteómicos se sustanciaron mediante análisis metabolómico, y revelaron un aumento de los metabolitos lipídicos y los cuerpos cetónicos (acetato, betahidroxibutirato). No se conoce la contribución del remodelado metabólico a la FA que se hace persistente. Sin embargo, las alteraciones metabólicas parecen preceder a la aparición de la FA, lo cual sugiere que no son únicamente una consecuencia de esta. En orejuelas auriculares humanas procedentes de pacientes con o sin FA postoperatoria, se observó que había desregulación de metabolitos cardiacos y alteración de las concentraciones de enzimas relacionadas con el metabolismo de la energía antes del inicio de las arritmias postoperatorias47. De manera análoga, las alteraciones proteómicas y metabolómicas observadas en un modelo animal de un sustrato de FA en evolución (marcapasos taquicárdico ventricular en el perro) señalan la importancia clave de los cambios metabólicos, el estrés oxidativo y la lesión estructural asociada a la insuficiencia cardiaca congestiva y las alteraciones profibrilatorias en la aurícula izquierda48.

En la segunda mitad del siglo xx hemos asistido a la generalización de las intervenciones quirúrgicas mínimamente invasivas para las ECV, así como a una aplicación más amplia de diversas moléculas farmacológicas, como estatinas, bloqueadores beta y tratamientos antiagregantes plaquetarios y anticoagulantes, que han llevado a una enorme mejora en los resultados clínicos y el pronóstico de los pacientes con ECV. Al mismo tiempo, la generalización de las pruebas estándares no invasivas y rápidas para detección precoz o valoración de los factores de riesgo ha mejorado ciertamente el diagnóstico y los tratamientos preventivos. Sin embargo, las ECV rara vez se atribuyen a un único factor. En los últimos años, se ha puesto de manifiesto la necesidad de nuevos biomarcadores para las ECV, con objeto de estratificar mejor a los pacientes y determinar su respuesta al tratamiento. Hoy se considera a los biomarcadores entidades únicas. En una época de tecnologías de alto rendimiento, han aparecido nuevos enfoques para abordar múltiples biomarcadores en el diagnóstico clínico y el pronóstico. Por ejemplo, los espectrómetros de masas están ya en el uso clínico para el diagnóstico perinatal y toxicología. Mientras que los inmunoanálisis y los métodos bioquímicos han dominado el campo de los análisis clínicos, las técnicas de alto rendimiento podrían pasar a utilizarse más ampliamente para los biomarcadores de la ECV en los próximos años.