Se analizaron datos demográficos (sexo y edad), clínicos (clase funcional de la New York Heart Association [NYHA], prueba de marcha de 6 minutos, síncope), hemodinámicos (presión en aurícula derecha, presión arterial pulmonar media, índice cardiaco y resistencia vascular pulmonar arteriolar, respuesta al test agudo vasodilatador) y parámetros de función pulmonar (flujo espiratorio en 1 s, capacidad vital forzada y capacidad de difusión de monóxido de carbono de todos los pacientes al diagnóstico. Se realizó cribado clínico y radiológico del síndrome de small patella en portadores de mutaciones en TBX4.

Se llevó a cabo la secuenciación de los exones y las uniones intrón-exón de BMPR2, TBX4 y KCNK3 y el estudio de reordenamientos cromosómicos mediante multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) (anexo 1 del material suplementario).

Las variantes identificadas se clasificaron según su frecuencia en población general considerando mutaciones a las ausentes o con frecuencias alélicas muy bajas (< 0,01%) en bases de datos públicas (Exome Variant Server, 1000G y ExAC1S-3S del material suplementario). Se evaluó la patogenicidad de las variantes teniendo en cuenta, además, su efecto en la proteína, su publicación previa en la bibliografía, la evidencia de cosegregación con la enfermedad y los resultados de predictores bioinformáticos (Polyphen-2, MutationTaster4S,5S delmaterial suplementario, SIFT [Sorting Intolerant from Tolerant], MutPred, SNPs&GO). Así, las variantes encontradas se clasificaron en patogénicas, posiblemente patogénicas, variantes de significado incierto y variantes no patogénicas (anexo 2 del material suplementario). Una vez completado el estudio de los probandos, se llevó a cabo el estudio genético de familiares de primer grado de pacientes portadores de mutación y se elaboró el árbol genealógico.

Se utilizaron los programas Stata (versión 13, Stata Corp.; College Station, Texas, Estados Unidos) e IBM SPSS 22 (SPSS, Inc.; Chicago, Illinois, Estados Unidos), y los datos se presentaron como media ± desviación estándar con nivel de significación en p ≤ 0,05. Se realizó un análisis de supervivencia univariante de Kaplan-Meier tomando como origen del seguimiento el momento del diagnóstico y el final del seguimiento el día 15 de junio de 2015, con un seguimiento máximo de 15 años (censura tipo I generalizada). Se utilizó el log rank test para la comparación de supervivencias de los pacientes con HAPI y HAPH y las formas asociadas a los distintos genes; el valor del evento se definió como muerte o entrada en la lista de espera de trasplante pulmonar. Se calculó la hazard ratio y el intervalo de confianza del 95% de los factores clásicos (presión en aurícula derecha, índice cardiaco, prueba de marcha de 6 minutos, clase funcional de la NYHA al diagnóstico, sexo, presión pulmonar media arterial pulmonar y resistencia vascular pulmonar) y se incluyó la etiología heredable. Además, se evaluó la interacción entre los factores clásicos y el hecho de ser heredable. Las variables que en el análisis univariable mostraron un nivel de significación de p < 0,10 se incluyeron en el modelo de regresión de Cox multivariable, se aplicaron un método de selección por pasos hacia delante y un método de selección por pasos hacia atrás para confirmar los resultados.

El estudio se ajusta a los principios de la Declaración de Helsinki y a la ley de protección de datos personales y fue aprobado por los comités éticos de los centros participantes. Todos los pacientes otorgaron su consentimiento informado.

El estudio genético fue positivo para alguna variante en los tres genes analizados en 31 probandos (18,78%): 16 con HAPI (11,10%) y 15 con HAP familiar (68,18%). Se identificaron 19 variantes en BMPR2 (tabla 1S del material suplementario) en 24 probandos, 3 variantes en TBX4 en 4 probandos y 2 variantes en KCNK3 en 3 probandos (tabla 2S del material suplementario). En la tabla 2 se muestran las características basales según el gen afectado.

Impacto pronóstico de las alteraciones genéticas (análisis de supervivencia Kaplan-Meier)

La media de seguimiento fue 7,74 ± 4,46 años. El análisis de supervivencia no mostró diferencias significativas entre HAPI y HAPH (figura A), y hubo diferencias significativas solo entre las formas de HAPH asociadas a TBX4, KCNK3 y BMPR2 (figura B).

Figura.

Curvas de Kaplan-Meier de comparación de supervivencia. A: HAPI frente a HAPH. B: HAPH con mutación en BMPR2, KCNK3 y TBX4. HAPH: hipertensión arterial pulmonar heredable; HAPI: hipertensión arterial pulmonar idiopática.

(0.12MB).

En la tabla 4 y en la tabla 5 se muestran los resultados de los análisis univariable y multivariable (log función de verosimilitud = –103,29; log rank χ2 = 13,03; p = 0,005).

Rechazaron el estudio genético 2 de las 19 familias a las que se lo propuso, y les aceptaron 72 de los 90 familiares (80%) de las 17 familias restantes. Se encontró a 21 portadores sanos (29,1%) y 6 portadores afectados (8,3%). Las características de los portadores se muestran en las tablas 4S y 5S del material suplementario. La penetrancia estimada de las mutaciones en BMPR2 fue del 23,5%; en KCNK3, del 25,0%, y en TBX4, del 33,0%.

En nuestra serie, el perfil clínico de las formas heredables en su conjunto es similar al asociado a BMPR2 descrito previamente4,7,9,12,19. Destaca que el 31,81% de los pacientes con HAPH presentan un estudio genético negativo, datos superiores a lo publicado2,3.

Se ha encontrado 19 mutaciones en BMPR2, con un 42% de mutaciones de tipo missense, cifras algo superiores a lo descrito4. Once de ellas no han sido descritas previamente, lo cual pone de manifiesto la alta complejidad de este gen, del que continúan apareciendo nuevas alteraciones5,20 a pesar de haberse estudiado ampliamente. Si bien estos cambios se distribuyen por todo el gen afectando a los distintos dominios proteicos, 8 de ellos (42%), una frecuencia mucho mayor que la descrita4, se localizan en el exón 2, lo cual podría traducir la existencia de un «punto caliente» para mutaciones en dicho exón, al menos en la población española.

Cabe destacar el hallazgo de la mutación c.653_676dupATAAAGGCTCCTTGGATGAGCG, una duplicación de 22 pares de bases, ya que nunca antes se había descrito este tipo de cambio en relación con el desarrollo de HAP. Esta mutación podría caracterizarse por una mayor penetrancia (el 50,0 frente al 23,5%), un hallazgo novedoso con posibles implicaciones futuras.

En cuanto al fenotipo asociado a BMPR2, los hallazgos descritos hasta la fecha se confirman en nuestra serie (tabla 2)4–9,20, y llama la atención la menor proporción de mujeres en las formas hereditarias de la enfermedad, hecho nunca antes indicado. Se confirma la «ventaja respiratoria» descrita por Girerd23,24 en las formas asociadas a BMPR2, ausente en la formas idiopáticas y en otras formas hereditarias, lo cual podría reflejar un proceso fisiopatológico distinto en el sistema vascular pulmonar en relación con la vía BMPR2/Smad. No se han observado diferencias significativas en el fenotipo según el tipo de mutación en BMPR2, en contra de lo indicado en otros trabajos8.

Existen hasta la fecha 9 casos de HAP asociada a KCNK3: la serie de Ma et al.13 con 6 pacientes y nuestra serie, con 3 pacientes portadores de 2 variantes patogénicas no descritas previamente. Al tratarse de un gen relacionado hace relativamente poco, es esperable el descubrimiento de nuevas mutaciones en el futuro. Nuestro grupo ha descrito, en un paciente de padres consanguíneos con una forma agresiva de la enfermedad, por primera vez una mutación en homocigosis en KCNK3 (p.Gly106Arg), de la que era portadora la madre afectada. La presencia de ambos alelos mutados en el caso índice podría explicar la agresividad del cuadro, si bien son necesarios futuros estudios para confirmarlo.

Nuestros hallazgos indican, al igual que el trabajo de Ma et al.13, la presencia de un fenotipo más agresivo de las formas asociadas a KCNK3, si bien comparten ciertas características con las formas asociadas a BMPR2, como herencia autosómica dominante, penetrancia incompleta e inicio predominante en la edad adulta. Existen investigaciones dirigidas a restablecer la función de dicho canal25,26, lo cual puede abrir en el futuro una nueva línea de tratamiento en estos pacientes.

Además de nuestra serie con 4 pacientes con mutaciones patogénicas en TBX4, solo se ha publicado la serie original de 7 casos de Kerstjens-Frederikse et al.14. Destaca que todos nuestros pacientes con HAP de inicio en la infancia portaban los cambios en el exón 8 y los pacientes con presentación adulta, en el exón 3, fenómeno no observado en la serie de Kerstjens-Frederikse et al.14, en la que los casos de presentación infantil presentaban cambios en ambos exones indistintamente.

Se ha descrito escasamente el fenotipo de este subgrupo de pacientes, aunque se ha señalado que se trata de una forma de presentación predominantemente infantil y de menor agresividad, frecuentemente asociada al síndrome de small patella, si bien ninguno de nuestros pacientes cumple criterios diagnósticos de esta displasia esquelética. Nuestros resultados confirman esos hallazgos, sin ningún evento de muerte o trasplante tras un seguimiento medio de 21,75 años, a pesar de la gravedad hemodinámica basal. La HAP asociada a mutaciones en TBX4 podría representar, por lo tanto, una forma más benigna de la enfermedad, aunque son necesarios más estudios que confirmen esta hipótesis.

En la población con HAPI, el análisis univariable mostró un impacto pronóstico de los factores clásicos derivados de registros poblacionales como el sexo masculino, la prueba de marcha de 6 minutos y resistencia vascular pulmonar arteriolar, de manera similar a lo publicado previamente27,28, si bien la etiología heredable y la clase funcional de la NYHA basal no presentaron significación, en contra de lo publicado12,27,28;9S,14S del material suplementario (tabla 4). En el análisis multivariable, solo el test de 6 min y el sexo masculino mantuvieron dicho efecto. En el subgrupo de HAPH, el sexo masculino y los parámetros pronósticos clásicos, relacionados con estadios avanzados de la enfermedad (presión de aurícula derecha, resistencia vascular elevada y clase funcional avanzada) mostraron también un impacto negativo en el análisis univariable, aunque solo la clase funcional al diagnóstico mantuvo la significación en el análisis multivariable de este subgrupo. Así, el diagnóstico en clase funcional III o IV de la NYHA en el subgrupo de HAPH se relaciona con un riesgo 3,5 veces superior de entrada en lista de trasplante pulmonar o muerte (tabla 5), hecho previamente no indicado que pone de relevancia la necesidad de un diagnóstico precoz.

Se ha obtenido un porcentaje significativo de negativas al cribado genético o ecocardiográfico entre los familiares, hecho publicado por otros grupos28. Sin embargo, debido al impacto pronóstico del diagnóstico precoz observado especialmente en las formas hereditarias, parece fundamental lograr un adecuado cribado de familiares y detectar tempranamente a los portadores asintomáticos. De esta manera cobra especial interés el desarrollo de programas de seguimiento de portadores sanos, campo actualmente en intensa investigación28–30.

En cuanto a la penetrancia de las alteraciones descritas, en nuestra población se observa una penetrancia incompleta con gran variabilidad interfamiliar en los 3 genes estudiados, y destacan las marcadas diferencias en función del tipo de mutación en las formas asociadas a BMPR2, si bien la penetrancia general de BMPR2 en nuestra serie es superponible a la publicada previamente6,19. Nuestro grupo es el primero en describir la penetrancia asociada a mutaciones en TBX4, y son necesarios estudios futuros para confirmar nuestros hallazgos.

Si bien el presente estudio ha analizado la mayor muestra española de pacientes con HAP, se debe interpretar con precaución estos hallazgos, fundamentalmente porque se incluyen casos prevalentes e incidentes, por lo que hay una dispersión significativa en cuanto a la fecha del diagnóstico, con el posible sesgo de supervivencia subyacente. Por otro lado, se han estudiado 3 de los genes relacionados con el desarrollo de la enfermedad, incluido BMPR2, el principal gen asociado con la enfermedad, pero se sabe que existen muchos más genes relacionados con la enfermedad que se debería incluir en futuros estudios13,15,16. En cuanto a la categorización de la patogenicidad de las mutaciones encontradas, se trata de una estimación basada en diversos parámetros clínicos y genético-moleculares, y para confirmarla es necesario demostrar cosegregación de la mutación con el fenotipo y/o la realización de estudios funcionales.