El proyecto SUN es un estudio de cohortes prospectivo y polivalente que incluye a titulados españoles en un entorno del Mediterráneo: España22. La preselección de participantes comenzó en 1999 y la inclusión en el estudio está abierta permanentemente. El identificador es NCT02669602 en ClinicalTrials.gov. La descripción detallada de los métodos se ha publicado en otro lugar22. En resumen, los datos de referencia y de seguimiento se recopilan cada 2 años mediante cuestionarios facilitados por los participantes por correo postal o publicados en internet22. La cohorte SUN recopila información sobre una amplia gama de características facilitadas por los participantes y previamente validadas, entre las cuales se encuentran variables antropométricas (como el índice de masa corporal)22, antecedentes clínicos (como la concentración de colesterol total23, la presión arterial24 y las cifras de glucemia25) y factores sociodemográficos y relacionados con el estilo de vida (como el cuestionario semicuantitativo de frecuencia alimentaria de 136 ítems26, el tabaquismo22 y la actividad física27). El protocolo de investigación se redactó de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki y fue aprobado por el comité de revisión institucional de la Universidad de Navarra. Se solicitó el consentimiento informado por escrito específico para participar en este estudio.

En mayo de 2008 se invitó a 1.921 adultos mayores de 55 años que habían respondido al cuestionario inicial a participar en un estudio genético28. De ellos, 1.085 aceptaron participar y 986 enviaron muestras de saliva28, aunque solo se pudo analizar correctamente 953 muestras. Además, se excluyó a 67 participantes que tenían un consumo total de energía que estaba fuera de los valores predefinidos de Willett (< 800 o > 4.000kcal/día los varones y <500 o > 3.500kcal/día las mujeres)29. El número final de participantes con que se contó para este estudio transversal fue 886 (figura 1 del material adicional).

El objetivo principal fue el acortamiento de la LT. Las muestras de saliva de los participantes se recogieron con equipos especializados (DNA Collection-Oragene OG-250 Saliva Kit). El ADN se extrajo según las instrucciones del fabricante y se congeló a –80°C. La medición de la LT se realizó con la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR), múltiple y monocromática, según el método de Cawthon descrito en otro lugar30. La relación T/S, que es proporcional a la LT media, se obtiene mediante la comparación de esta medición con la de un ADN de referencia. La master mix contenía 10 ng de ADN genómico, un equipo de PCR QuantiTect CYBR Green (Qiagen), cebadores de telómero y albúmina, y agua libre de nucleasas para completar el volumen final (10 μl). Se combinaron cebadores de telómeros (telc y teg) y cebadores de albúmina (albu y albd) (concentración final, 900 nm cada uno). Las secuencias del cebador (Sigma Aldrich St Louis, Estados Unidos), purificadas mediante cromatografía líquida de alta resolución, fueron telg (5′-ACACTAAGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTTTGGGTT AGTGT-3′), telc (5′-TGTTAGGTATCCCTATCCCTATCCCTA TCCCTATCCCTAACA-3′), albu (5′-CGGCGGCGGGCGG CGCGGGCTGGGCGGAAATGCTGCACAGAATCCTTG-3′) y albd (5′-GCCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGGA AAAGCATGGTCGCCTGTT-3′). La qPCR utilizada fue CFX 384TM Real-Time System (BioRad) con el siguiente protocolo: 15 min a 95°C para la activación de la enzima, seguida de 2 ciclos de 15 s a 95°C y 15 s a 49°C, y 35 ciclos de 15 s a 95°C, 10 s a 63°C, 15 s a 74°C (adquisición de la primera señal) y 15 s a 88°C (adquisición de la segunda señal). Para cada muestra, se generó una curva de fusión de 45 a 95°C con una pendiente de 0,2°C/s. Se utilizaron placas de 384 pocillos; para el control de calidad, las muestras se procesaron por triplicado.

En cada placa de alto rendimiento se incluyó una curva de calibración de las muestras de ADN de referencia (150–2,34 ng/ml en diluciones dobles; acuerdo de linealidad, R2 > 0,99).

El índice de SCV se definió en función de 7 factores de riesgo clave: tabaquismo, actividad física, dieta, índice de masa corporal, concentración de colesterol total, glucemia en ayunas y presión arterial. Cada ítem se clasificó en 3 niveles: «pobre», «intermedio» e «ideal», y se asignaron puntuaciones de 0, 1 y 2 respectivamente, de acuerdo con las definiciones de la AHA3 (tabla 1). Por lo tanto, la puntuación total osciló entre 0 y 14, y nuestra variable se clasificó en 3 grupos: pobre (0-9 puntos), intermedio (10-11 puntos) e ideal (12-14 puntos). Las variables se tomaron del cuestionario inmediatamente antes de la recogida de saliva, a excepción de la actividad física y el Healthy Eating Index, que solo tienen datos en el cuestionario de referencia.

El estado del tabaquismo se clasificó como pobre (fumadores en activo), intermedio (exfumadores) e ideal (no fumadores). La actividad física se clasificó, de acuerdo con la frecuencia y la duración, de intensidad moderada y vigorosa de cada actividad como pobre (sin ejercicio), intermedia (1-149 min de ejercicio moderado o 1-74 min de ejercicio vigoroso por semana) e ideal (> 150 min de ejercicio moderado o > 75 min de ejercicio vigoroso por semana).

La dieta se evaluó con el Alternative Healthy Eating Index (AHEI-2010). Se utilizó la información proporcionada por Chiuve et al.31 de este índice. Osciló entre 50 y 110. Este índice se basa en alimentos y nutrientes que predicen el riesgo de enfermedades crónicas31. Verduras, frutas, bebidas azucaradas y zumos de frutas, legumbres y frutos secos, carne roja/procesada, ácidos grasos trans, ácidos grasos omega 3 de cadena larga, ácidos grasos poliinsaturados, sodio y la ingesta de alcohol se puntuaron de 0 a 10. En este análisis, el AHEI-2010 se dividió en calidad de la dieta mala (< 50), intermedia (≥ 50-≤ 80) e ideal (> 81)32.

El índice de masa corporal se clasificó como pobre (≥ 30), intermedio (≥ 25-< 30) e ideal (< 25). La presión arterial se clasificó utilizando la presión arterial sistólica (PAS en mmHg) y la presión arterial diastólica (PAD en mmHg) como pobre (PAS ≥ 140 o PAD ≥ 90), intermedia (PAS ≥ 120-< 140 o PAD ≥ 80-< 90) e ideal (PAS < 120 o PAD < 80). Para los participantes con solo 1 medición de presión arterial registrada, se utilizó esa única lectura. Respecto a los datos no disponibles, se consideró con PAS deficiente a los participantes que tomaban cualquier medicación antihipertensiva y con PAS y PAD ideales a los que informaron no tener hipertensión en aquel momento. El colesterol se clasificó en pobre (≥ 240mg/dl), intermedio (≥ 200-< 240mg/dl) e ideal (< 200mg/dl). La glucosa en ayunas se clasificó como pobre (≥ 126mg/dl), intermedia (≥ 100-≤ 125mg/dl) e ideal (< 100mg/dl). Respecto a los datos no disponibles, se consideró con colesterol bajo a los participantes con diagnóstico de hipercolesterolemia o tomaban cualquier fármaco hipocolesterolemiante, y con colesterol ideal a los que comunicaron que no tenían colesterol en aquel momento.

La información sobre las covariables se recopiló en el cuestionario de referencia del proyecto SUN, que incluye la edad en el momento de la recogida de saliva y la edad en el momento de la inclusión (años), el sexo, el estado civil, los años de formación universitaria, los antecedentes familiares de hipertensión, diabetes, obesidad y ECV, y las prevalencias de cáncer y depresión. Se incluyeron otras covariables, como sedentarismo, dietas especiales, consumo de alcohol, ingesta de sodio y consumo de alimentos ultraprocesados.

En el análisis principal, se dividió a los participantes en terciles según el índice de SCV: pobre (0-9), intermedio (10-11) e ideal (12-14). Se evaluaron las características de la muestra de estudio de acuerdo con las categorías de SCV mediante la ponderación por probabilidad inversa con ajuste por edad según la recogida de saliva y el sexo. Respecto a las variables continuas, se utilizaron medias ± desviación estándar y porcentajes para las variables cualitativas. Como control de calidad en nuestro estudio, se utilizó la correlación de Spearman para evaluar la asociación entre LT y edad a la recogida de saliva. También se utilizó la correlación de Spearman para evaluar la asociación entre LT y SCV.

Se calcularon el número y el porcentaje de participantes por número de ítems. Además, se calculó el número de participantes mediante ítems de SCV ideales.

Como se había hecho con anterioridad21,33,34, se definió como telómero corto aquel con una LT por debajo del percentil 20. Para evaluar la relación entre el índice de SCV o los ítems de SCV y el hecho de tener telómeros cortos, se ajustaron los modelos de regresión logística para calcular la odds ratio (OR) y los intervalos de confianza del 95% (IC95%), considerando el primer tercil (SCV pobre) como categoría de referencia. Se ejecutaron 2 modelos ajustados: el primero ajustado por edad a la recogida de la muestra y sexo, y el segundo, además, ajustado por edad a la inclusión, el estado civil (soltero, casado, viudo o divorciado), los años de formación universitaria, los antecedentes familiares de hipertensión, diabetes, obesidad y ECV, y las prevalencias de cáncer y depresión. Además, se realizaron pruebas de tendencia lineal mediante terciles sucesivos asignando a cada participante el valor de la mediana en su tercil y considerando estas variables como continuas.

Se realizó un análisis de covarianzas (ANCOVA) para evaluar la LT media ajustada según los terciles del índice de SCV. Para evaluar la relación de cada uno de los terciles superiores (SCV intermedia e ideal) con el tercil inferior (SCV pobre), se llevaron a cabo modelos ajustados de regresión lineal multivariable.

Se realizaron modelos de regresión lineal multivariable de la LT con el índice de SCV para explorar la relación lineal entre estas 2 variables.

El valor de p de la interacción entre el sexo y el índice de SCV se calculó mediante la prueba de razón de verosimilitud en cada supuesto.

También se realizaron análisis de sensibilidad para verificar la solidez de nuestros hallazgos volviendo a ejecutar el modelo con ajustes adicionales: utilizando los percentiles 5 y 95 como límites del consumo total permitido de energía, alimentos ultraprocesados y consumo de alcohol, después de una dieta especial al inicio, ingesta de sodio, sedentarismo y aumento de peso, y excluyendo a los participantes con antecedentes personales de obesidad, ECV, diabetes o hipertensión.

Se utilizaron análisis de regresión logística para calcular la probabilidad predicha y observada, con las probabilidades de tener una LT corta (≤ percentil 20) como variable dependiente y el número de ítems del índice de SCV como variable independiente. Después se realizó el gráfico con las probabilidades marginales observadas y predichas.

Los análisis estadísticos se realizaron con STATA versión 14.0 (StataCorp). Se consideraron estadísticamente significativos los valores de p de 2 colas < 0,05.

Entre las fortalezas de este estudio se encuentran la técnica utilizada para la medición de la LT (RT-qPCR) que permite cuantificar los telómeros y el gen de copia única en el mismo pocillo con una sola reacción, lo que reduce los posibles errores de medición.

Sin embargo, este estudio también tiene algunas limitaciones. En primer lugar, los participantes de la cohorte SUN tenían un perfil más sano probablemente porque eran titulados universitarios y por ello eran más conscientes de la importancia de una buena dieta y un estilo de vida saludable; por lo tanto, es posible que este estudio no represente a la población general. En segundo lugar, el escaso número de mujeres de nuestro estudio puede explicar las diferencias encontradas entre los sexos. En tercer lugar, se aisló ADN de muestras de saliva que contenían leucocitos y células epiteliales en proporciones variables43. A pesar de que la medición de la LT es diferente según el tipo celular o el tejido, los valores de LT salival y leucocitaria están correlacionados43,44. Además, el método es menos invasivo para los participantes. En cuarto lugar, el diseño del estudio es transversal, de modo que no se pueden inferir efectos causales. En quinto lugar, nuestra capacidad para detectar relaciones pequeñas, especialmente en los análisis estratificados, puede estar limitada por el tamaño muestral relativamente pequeño. En sexto lugar, no es lo mismo estudiar la LT como variable continua en toda la población que evaluar el efecto del índice de SCV, especialmente en los participantes con una LT más corta (por debajo del percentil 20), que es un resultado de mayor magnitud. Estas diferencias pueden explicar la imposibilidad de encontrar relaciones lineales entre la LT y el índice de SCV. Posiblemente, un índice de SCV ideal solo puede ejercer una función protectora con resultados de mayor alcance que con pequeños cambios en la TL en toda la población.